Caracterización de Aceites Esenciales de Eucalipto (Eucalyptus globulus labill)

I. RESUMEN:

La especie Eucalyptus globulus labill, es una hierva perenne muy fragante que alcanza una altura de 40 a 65 m. se puede encontrar cultivado en muchas regiones del mundo para la producción de madera, fabricación de pulpa de papel y obtención de aceite esencial. El aceite esencial de esta especie no ha sido estudiada en su totalidad. 

 

Muchas veces algunos aceites esenciales son reemplazados por compuestos orgánicos sintéticos disminuyendo así la calidad de los productos en los que son utilizados, dado estos inconvenientes se realiza el proceso de caracterización del aceite esencial de eucalipto; algunas de las propiedades fisicoquímicas de estos aceites como volatilidad y estabilidad a las diferentes temperaturas de trabajo, se puede utilizar la cromatografía gaseosa asociada a un detector de masas para la identificación de sus componentes característicos. Para identificar asi su pureza se: utilizo el metodo del picnómetro de 10.067ml (Germay ln20ºC); solubilidad en etanol, que consiste en adicionar progresivamente al aceite una solución acuosa de etanol de tal manera que según el grado de solubilidad se clasifica los aceites (a.e, soluble en agua “V”) finalizando con la prueba de residuo por evaporación a esta inyectando temperatura para la evaporación y pesar el residuo restante.

II. INTRODUCCIÓN.

El género Eucalyptus natural de Australia y de Tasmania, con más de 300 especies, con capacidad de absorción del agua que convierte a los eucaliptos en especies muy agresivas para el medio ambiente al transformar los ecosistemas por desecación de la tierra donde se plantan y entre ella la especie Eucalyptus globulus labill, es una hierva perenne muy fragante que alcanza una altura de 40 a 65 m. de tallos erectos con corteza que se deshace de color gris azulado, por la rapidez de crecimiento, se puede encontrar cultivado en muchas regiones del mundo para la producción de madera, fabricación de pulpa de papel y obtención de aceite esencial. 

Las características de los aceites esenciales se efectúa llevando acabo una serie de análisis que ofrecen valores que estimaran el grado de pureza que presenta un aceite esencial y principalmente al determinar su composición. La mayoría de estos análisis cae  en la categoría de análisis  fisicoquímicos.  La mezcla de componentes volátiles producto del metabolismo secundario de las plantas en cuya composición interviene una porción de hidrocarburos de la serie polimetilénica del grupo de los terpenos que responden compuestos casi siempre oxigenados (alcoholes, ésteres, éteres, aldehídos y compuestos fenólicos) que son los que transmiten a los aceites el aroma que los NB caracteriza, la siguiente práctica se realizo con objeto de Conocer los análisis fisicoquímicos que permiten determinar las características de los aceites esenciales y establecer la calidad de estos.
 

III. MARCO TEÓRICO.

1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA:

• Nombre vulgar: Eucalipto.
• Nombre científico: Eucalyptus globulus Labill.
• Reino: vegetal
• Clase: Angiospermae
• Orden: Myrtiflorae
• Familia: Myrtáceas
• Género: Eucalyptus 

• Hábitat: Es natural de Australia y de Tasmania, donde se pueden encontrar más de 300 especies del género Eucalyptus. Por la rapidez de crecimiento, se puede encontrar cultivado en muchas regiones del mundo para la producción de madera, fabricación de pulpa de papel y obtención de aceite esencial. Ha sido especialmente utilizado para sanear zonas pantanosas al eliminar la humedad de las mismas con la consiguiente erradicación de sus plagas de insectos, principalmente mosquitos, y de las enfermedades que transmiten. Su uso ha supuesto una gran ayuda para el control del paludismo en muchas zonas de Asia, América del sur y el sur de Europa. Por otra parte, esta capacidad de absorción del agua, convierte a los eucaliptos en especies muy agresivas para el medio ambiente al transformar los ecosistemas por desecación de la tierra donde se plantan. Se utiliza ampliamente como árbol de jardín. 

• Características: Árbol perenne de la familia de las mirtáceas de 40 a 65 m de altura. Tallos erectos con corteza que se deshace de color gris azulado. Hojas adultas alternas, lanceoladas de hasta 30 cm de longitud, pecioladas, con el nervio central muy marcado, verde oscuro, brillante, de textura endurecida; hojas jóvenes, sin peciolo que abrazan el tallo, de color verde gris y opuesto. Flores solitarias o reunidas en umbelas de 3 con numerosos estambres muy destacados y sin pétalos. Frutos en cápsula leñosa de hasta 2,5 cm de longitud, con hasta 4 celdas que contienen un gran número de semillas.  

• Cosecha y Rendimiento: en sitios de buena calidad crese rápido y puede lograr incrementos medios anuales entre 20 y 34 m3 por hectárea. Por su dureza y resistencia al ataque de patógenos, la madera del eucalipto es ampliamente usada en construcciones, en mineria , como durmientes en líneas férreas , además produce celulosa de buena calidad para la fabricación de papeles y cartón. Los árboles son muy útiles en la construcción de barreras vivas o rompe vientos. Las hojas tiernas son muy utilizadas para la extracción de aceites esenciales. La corteza se emplea como curtiente por ser rica en tanino, denominado Kino la esencia de  algunas especies de eucalipto se utiliza como combustible y para preparar gas. 

Los aceites esenciales son mezclas complejas, normalmente líquidas, que presentan una característica: “su volatilidad”, por tanto son extraíbles en corriente de vapor de agua. En general son los responsables del olor de las plantas. Los aceites esenciales generalmente tienen cantidades  de Terpenos, los cuales  sirven principalmente como vehículos para los grupos mas importantes de compuestos orgánicos mas oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos y esteres), los cuales aunque presentes en cantidades mucho menores, son estos los portadores del olor característico del aceite  en cuestión.


Se definen, según AFNOR (1998) como: “productos obtenidos a partir de una materia prima vegetal, bien por arrastre con vapor, bien por procedimientos mecánicos a partir del epicarpio de los Citrus, o bien por destilación seca. El aceite esencial se separa posteriormente de la fase acuosa por procedimientos físicos en los dos primeros modos de obtención; puede sufrir tratamientos físicos que no originen cambios significativos en su composición (por ejemplo, re-destilación, aireación)”.

Los compuestos disueltos en aceites esenciales se pueden clasificar como sigue:

• Esteres. Principalmente de ácido benzoico, acético, salicílico y cinámico.
• Alcoholes. Linalol, geraniol, citronelol, terpinol, mentol, borneol.
• Aldehídos. Citral, citronelal, benzaldehído, cinamaldehído, aldehído cumínico, vainillina.
• Ácidos. Benzoico, cinámico, mirística, isovalérico todos en estado libre.
• Fenoles. Eugenol, timol, carvacrol.
• Cetonas. Carvona, mentona, pulegona, irona, fenchona, tujona, alcanfor, metilnonil cetona, metil heptenona.
• lactonas. Cumarina.
• Terpenos. Canfeno, pineno, limoneno, felandreno, cedreno.

1. Esteres. Son compuestos que derivan de la reacción de un alcohol primario ó secundario con un ácido eliminando una molécula de agua, de fórmula general R-C00-R; donde R y R son radicales monovalentes. Los esteres se nombran cambiando la terminación ico del ácido por ato seguido del nombre.
2. Terpenos. Con el nombre de terpenos se conoce a un grupo importante de componentes vegetales que tienen un origen biosintético común. Todos, aunque con estructuras químicas muy distintas, proceden de la condensación, en número variable, de unidades isoprénicas. La ruta biogenética se inicia por condensación de dos moléculas de AcCoA, dando acetoacetil-CoA el cual se condensa a su vez con otra molécula de AcCoA originando 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Este compuesto se reduce para convertirse en ácido mevalónico (3,5-dihidroxi-3-metilvaleriánico) y posteriormente por fosforilación y descarboxilación, en isopentenilpirofosfato (IPP), el cual, por isomerización da lugar a dimetilalil-pirofosfato (DAMPP), compuesto altamente reactivo. La condensación, mediante unión “cabeza-cola” de estos dos últimos compuestos origina el geranil-pirofosfato (GPP) que posee 10 átomos de carbono y es precursor de un gran número de principios activos vegetales (monoterpenos, iridiodes, algunos alcaloides, etc). El acoplamiento a este GPP de nuevas unidades de IPP origina moléculas de mayor peso molecular, incrementándose el número de carbonos de cinco en cinco: sesquiterpenos (C-15), diterpenos (C-20), triterpenos (C-30), etc. Desde el punto de vista farmacéutico, los grupos de principios activos de naturaleza terpénica más interesantes son: monoterpenos y sesquiterpenos constituyentes de los aceites esenciales, derivados de  monoterpenos correspondientes a los iridoides, lactonas sesquiterpénicas que forman parte de los principios amargos, algunos diterpenos que poseen actividades farmacológicas de aplicación a la terapéutica y por último, triterpenos y esteroides  entre los que se encuentran las saponinas y los heterósidos cardiotónicos.
   

 3.   Iridoides Y Sesquiterpenos.

• Iridoides. Bajo la denominación de iridoides se agrupan una serie de monoterpenos bicíclicos (C10) derivados biosintéticamente del monoterpeno geraniol, que presentan como estructura básica común un ciclopentapirano denominado iridano, por haberse detectado la primera vez en unas hormigas pertenecientes al género Iridomirmex.. Estos compuestos pueden encontrarse como estructuras abiertas (secoiridoides) o cerradas (iridoides) generalmente en forma heterosídica, mayoritariamente como glucósidos.  Existen una serie de plantas que se emplean por sus propiedades farmacológicas precisamente porque algunos de sus principios activos son de naturaleza iridoídica.

• Lactonas sesquiterpénicas. Son compuestos que tradicionalmente han sido considerados como “amargos”. Se originan a partir del ácido mevalónico, derivando casi todos ellos de la estructura del germacranólido. Poseen diferentes actividades farmacológicas: antiinflamatoria, antimicrobiana, antimigrañosa, etc. Sin embargo, son también causantes de procesos alérgicos, principalmente dermatitis de contacto. Existen numerosas plantas que presentan este tipo de compuestos, muchas de ellas pertenecientes a las familias Asteraceae, Apiaceae y Magnoliaceae. Como se incluye a continuación una de las especies más empleadas, el Árnica.

 4. Diterpenos. Los diterpenos constituyen un grupo muy amplio de componentes de los vegetales cuya característica común es la de poseer una estructura básica con 20 carbonos y proceder biosintéticamente del ácido mevalónico aunque existan un gran número de estructuras distintas. Desde el punto de vista de su aplicación directa a la terapéutica, las plantas que contienen diterpenos,  carecen hoy por hoy de interés. Sin embargo, dentro de este grupo figuran importantes compuestos naturales de aplicación en terapéutica. Un ejemplo típico es el caso del taxol, también conocido como paclitaxel, compuesto obtenido a partir de las cortezas de tejo americano (Taxus brevifolia Nutt.) que ha mostrado una elevada eficacia en el tratamiento de algunos tipos de cánceres. Este compuesto es un diterpeno tricíclico con una función amida por lo que en ocasiones se considera como un pseudoalcaloide.

5.   Triterpenos y Esteroides. Este grupo de principios activos está constituido por numerosos compuestos,  estructuralmente muy similares, derivados mayoritariamente del epoxiescualeno o en menor número del propio escualeno. Todos ellos poseen un hidroxilo en el C3 que les permite la unión con una o varias moléculas glucídicas, dando lugar a estructuras heterosídicas. Pueden establecerse dos grandes grupos dependiendo de su estructura química: triterpenos (tetra y pentacíclicos) y esteroides. Se encuentran en estos grupos compuestos de gran interés farmacéutico como son los saponósidos y los heterósidos cardiotónicos.

6.   Saponósidos. También llamados saponinas, su nombre deriva  del latín sapo, saponis que significa jabón debido a que poseen propiedades tensioactivas, pues al disolverse en agua y por agitación forman espuma persistente, tienen propiedades detergentes. Muchas de ellas tienen además propiedades hemolíticas debido a que alteran la permeabilidad de las membranas biológicas resultando tóxicas para animales de sangre fría. Por esta razón, algunas plantas que contienen estos principios activos, han sido empleadas desde la antigüedad en el arte de la pesca. Sin embargo no todos los saponósidos cumplen estas características.

 A.    Análisis fisicoquímicos:

Entre los análisis de carácter general se encuentran la densidad, índice de refracción, solubilidad en etanol, residuo por evaporación, punto de congelación y desviación Polarimétrica (rotación óptica). Entre los análisis fisicoquímicos de carácter especifico (para un tipo de esencia), tenemos: el contenido de componentes carbonilados como   el cifral en hierba luisa y limón, índice  de mentona y mentol en menta y piperita, muña y hierba buena. Entre otros se   analiza  el índice de acidez, contenido de fenoles y alcoholes, etc.

1. Preparación de las mezclas. Una vez obtenido o extraído el aceite, la metodología general considera una etapa denominada  “Preparación  de la Muestra para el Análisis” que consiste en: 

• Eliminar el agua residual, mediante la adición de una cantidad de sulfato de magnesio.      Mas o menos el 10 %  del peso de aceite esencial (4.4gr.), mezclando y filtrando posteriormente.

• Llevar el aceite esencial  a la temperatura en que se va realizar los análisis (20 ºC) mediante  baño maría.

Son muchos los análisis  que se suelen aplicar a los aceites esenciales, entre los mas importantes se encuentran.

A.  Densidad. Consiste en medir  el peso de un volumen dado de aceite esencial, se utiliza el picnómetro y se expresa  en(g/l) .

B.  Índice De Refracción. Consiste  en la medida del ángulo de refracción del aceite  esencial manteniendo en condiciones de transparencia e isotropismo, siendo la longitud  de onda de luz  de 589.3 nm. que corresponden a la línea   D  del  sodio.  Se emplea un refractómetro clásico que permite la lectura directa de los índices  de  refracción comprendidos   entre 1300 y 1700 con precisión  de  +/-0.0002.

C.  Desviación Polarimétrica. Es la medida de  la rotación del plano de polarización   de luz, a una longitud  de onda definida, al atravesar un espesor determinado de aceite esencial. La longitud de onda es generalmente aquella correspondiente a la línea de sodio. Se utiliza un polarímetro cuya precisión debe ser por lo  menos igual a +/- 0.03. se emplean tubos de observación de longitud apropiada.

D.  Solubilidad En Etanol. Consiste en adicionar progresivamente al aceite esencial a una solución acuosa  de etanol en concentración adecuada y conocida, observando el grado de solubilidad.                    

Según el grado de solubilidad. Podemos clasificar a los aceites.

• Aceite esencial soluble en “V” volúmenes de etanol de  graduación dada “T “permanece  igual después de la adición posterior de l etanol  de la misma concentración, hasta enturbiar.

• Aceite esencial en “V” volúmenes de etanol de  graduación  dada “T”  que se enturbia  al diluir.

• Aceite esencial en “V” volúmenes de etanol de graduación  dada “T”    que se enturbia en “V”  volúmenes ( “V” menor que 20).

• Aceite esencial  soluble con opalescencia.

MÉTODOS DE ANÁLISIS DE ACEITES

ESENCIALES:

a.  Ensayos de reconocimiento.

Debido a la diversidad de grupos funcionales que pueden estar presentes en los componentes mono- y sesquiterpénicos de un aceite esencial no existe una prueba específica para su reconocimiento.

Otros reactivos útiles para revelar monoterpenos y sesquiterpenos son anisaldehído-ácido sulfúrico, vainillina-ácido sulfúrica y ácido fosfomolíbdico.

b.  Extracción y aislamiento.

Como se mencionó anteriormente, la mayoría de monoterpenos y sesquiterpenos se encuentran presentes en los aceites esenciales de diversas plantas. A partir de dichos aceites es posible realizar su aislamiento mediante la utilización de uno o varios métodos cromatográficos tales como la cromatografía en columna, en capa fina y HPLC. Para las cromatografías en columna y en capa fina se utiliza ampliamente la sílica gel como fase estacionaria. Como fase móvil se emplea solventes apolares puros o mezclados. Sin embargo actualmente se utilizan técnicas de separación más eficientes y rápidas como la cromatografía líquida de alta eficiencia HPLC, y la cromatografía de gases (GC), así como también combinaciones “online” HPLC-GC-MS.

c.  Caracterización espectral.

Los monoterpenos y sesquiterpenos en un buen número se pueden caracterizar químicamente a partir de los datos de cromatografía de gases y los espectros de masas tal como se anotó anteriormente, pero cuando existen dudas de tal caracterización se recurre a los métodos espectrales como Infrarrojo, Ultravioleta y Resonancia Magnética Nuclear.

d.  Espectro infrarrojo.

El espectro infrarrojo permite detectar la presencia de grupos hidroxilo, carbonilo, anillos aromáticos, enlaces dobles C=C. cis y trans, etc. Para determinar el espectro basta con colocar una gota del componente en una celda de NaCl.

e.  Espectro ultravioleta.

El espectro UV de los monoterpenos y sesquiterpenos permite el reconocimiento de grupos funcionales y grupos cromóforos. Por ejemplo el limoneno presenta un máximo de absorción en 262 nm (E = 6400). En general, la espectrofotometría ultravioleta tiene una utilidad limitada en el estudio de la gran mayoría de los aceites esenciales monoterpénicos, ya que pocos terpenos tienen grupos cromóforos. Sin embargo, en la fracción no volátil de los aceites esenciales cítricos se encuentran componentes carotenoides o con núcleos heterocíclicos oxigenados (cumarinas, furocumarinas sustituidas y polimetoxiflavonas), lo que da a estas esencias un comportamiento característico en el UV.

IV. MATERIALES Y MÉTODO.

B.   METODO.

1. Una vez obtenido o extraído el aceite, la metodología general considera una etapa denominada “preparación de muestras para el análisis” que consiste en:

• Eliminar el agua residual, mediante la adición de una cantidad de sulfato de magnesio anhídrido , mas que o menos al 10% del peso del aceite esencial, luego será filtrado y así en condiciones para someterse a las pruebas físico química. (Experimento. 1)

1. Determinación  de la densidad de Aceite Esencial. (Experimento 2)

• Obtener el peso del picnómetro completamente limpio y seco (Pv).

• Llenarlo completamente con agua destilada  a 20 ºC. colocar la tapa, observando la ausencia de burbujas en el interior o en el tubito de  la tapa. Secarlo muy bien  y pesar de nuevo (Pc).

• Vaciar el picnómetro  y secarlo cuidadosamente.

• Llenarlo el picnómetro con el líquido problema a la misma temperatura del agua (20 ºC). taparlo  y limpiar escrupulosamente el exterior.  Pesar de nuevo (Px).

• Calcular el peso específico  (Pe) aplicando la siguiente formula.

                 Pe = (Px - Pv) / (Pa -Pv)

1. Solubilidad En Etanol. (Experimento 3)

• Consiste en adicionar progresivamente el aceite esencial una solución acuosa de etanol de concentración adecuada  (70, 80, 90, 96).

• Se coloca dentro de un tubo de prueba de 1 ml. De aceite esencial medido con pipeta. Se coloca la probeta y su contenido en baño maría  a temperatura constante.

• Usando una bureta se añade la solución diluida  del etanol de concentración conocida, en incremento de 1 ml, hasta que el aceite  se disuelva completamente, agitando frecuentemente  y vigorosamente durante la adición  del solvente. Cuando la solución sea perfectamente clara, se anota el volumen de la solución de etanol añadido.

• Se continúa añadiendo el solvente en  incrementos de 1 ml hasta llegar  a 20 ml, se siguen agitando después de cada adición. Si la solución se pone turbia  y opalescente antes de haber agregado  un volumen total de 20 ml de etanol se anota   el volumen en el momento en que aparece  la turbidez  u opalescencia  y eventualmente el volumen en el cual desaparece.

1. Residuo Por Evaporación. (Experimento 4)

• Se pesa un gramo de muestra en una capsula de porcelana previamente tarada.

• Se evapora  en el baño maría sin interrupción a la temperatura y el tiempo adecuado para cada aceite esencial.

• Se deja enfriar la capsula y luego se coloca  en un desecador y se pesa.

V. RESULTADOS:

OBSERVACIONES:

1. Del experimento 1: 

• Al adicionar sulfato de magnesio al aceite esencial este hace que el aceite se clarifique, y se forma cristales de magnesio en la base del vaso precipitado.

• Cuando el aceite si filtra  la muestra es mas clara.

1. Del experimento 3:

• Cuanto mayor es el grado del alcohol que se usa menor cantidad de hidróxido de sodio se usa y la solubilidad es baja.

• Por lo tanto la turbidez va cayendo paulatinamente.

1. Teniendo como resultado toda las variaciones de solubilidad en etanol   a las diferentes temperaturas se observo que  a medida que se aumenta el grado del contenido de alcohol para titular disminuye el gasto del volumen,  esto nos permite decir que a mayor grado de alcohol  mayor solubilidad del aceite esencial.

1. En cuanto a   la comparación del residuo por evaporación se observo que  el aceite es bastante sensible al calor por eso, cuando el aceite se lleva  a  temperatura de 51ºC por un tiempo que varia de 8min.  resulta una evaporación de mayor cantidad del aceite.

1. En cuanto a la determinación del volumen del aceite esencial no se realizó satisfactoriamente, por que pudo apreciarse en el pesaje realizado del (Px) una mínima cantidad de agua, lo cual impidió tomar el peso exacto del aceite puro que era de nuestro interés.

1. Realizando las comparaciones en cuanto a la densidad, a medida que se incrementa la temperatura este  disminuye (densidad), entonces en las evaluaciones es necesario controlar la temperatura, debido a que cuando hay un incremento de calor sensible, la energía interna aumenta, en donde las fuerzas de repulsión son mucho mayores que las  de atracción, por tanto hay un movimiento mayor de las moléculas y estas se encuentran mas dispersas, lo cual ocasiona a que disminuya la densidad.

1. En los diferentes pesajes realizados se observó ligeras variaciones entre los datos, esto indica  que en el interior de la balanza analítica puede ser que haya acumulación de aire, lo cual hace que varié el peso cuando la muestra es pesada más de una vez, es decir,  que cuando se pone la muestra sobre la balanza. Otra causa posiblemente es el secado del picnómetro  no  ha sido  realizado apropiadamente, de tal manera que al hacer contacto con  la yema de los dedos, este  transfiera mínimas cantidades de masa (grasa o sudor).